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      菌種鑒定報告

      發布日期:2017-01-07

      1 材料與方法

      1.1 材料

      Taq EP0402 Fermentas

      DNA片段膠回收試劑盒AP-GX-50 Axygen

      pGEM-T 貨號A3600 Promega

      LB培養基   購于上海生工

      氨卡青霉素鈉   購于上海生工

      1.2 主要儀器

      PCR儀器   ABI 9700PCR

      電泳儀    BioRad

      高速離心機  Thermo

      高壓滅菌鍋   SANYO全自動高壓滅菌鍋

      移液器     Thermo

      1.3 方法

      1.3.1 菌落PCR

      使用27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1497RGGTTACCTTGTTACGACTT 進行擴增,引物為南京金斯瑞生物科技有限公司合成,儲存濃度為100μm,使用濃度為10μm。按照如下方法混合各種PCR反應溶液:Buffer(Kcl) 2.5μl, 2mMdNTPs 2.5μl27F 2μl , 1497R 2μl, 25Mm MgCl2 1.5μl, Taq 0.5μl, ddH2O 14μl. 混合后用10μl的吸頭撰取菌液在混和液中攪動一下,然后進行PCR

      PCR反應參數如下:94℃ 4min; 94℃ 30s50℃ 30s72℃ 2min30循環; 72℃ 10minPCR結束后,1%瓊脂糖鑒定,并使用Axygen AP-GX-50 DNA片段膠回收試劑盒回收PCR片段。

       

      1.3.2 T載體連接

      T載體連接PCR回收片段,按照如下混合:

      2×Rapid Buffer 5μl, T載體 1μl, 片段 3μl, T4 DNA Ligase 1μl. 混合后室溫1小時。

      1.3.3 轉化

      100μlJM109感受態細胞,冰上解凍,取10μl的連接產物混入,冰上靜置30min,然后42℃熱擊90s,迅速放入冰山靜置5min,加入LB培養基,37℃ 150rpm 培養1小時,然后涂布于LA(含50μg/mL的氨卡青霉素鈉),37度培養過夜,第二天菌落PCR鑒定陽性克隆。

      1.3.4 陽性克隆鑒定

      分別挑取一定數量的克隆,采用菌落PCR方法進行PCR鑒定(方法見1.3.1),同時用LA培養基培養每個克隆。鑒定結果用1%的瓊脂糖鑒定,取能PCR出陽性片段的克隆送測序

      1.3.5 測序比對

           使用網絡服務器http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi中的Blastn進行比對。


      2 結果

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